Robey IF, Baggett BK, Kirkpatrick ND, Roe DJ, Dosescu J, Sloane BF, Hashim AI, Morse DL, Raghunand N, Gatenby RA, Gillies RJ.
Arizona Cancer Center, University of Arizona, Tucson, Arizona, USA.
Rezumat
pH-ul extern al tumorilor solide este acid, ca o consecință a metabolismului crescut al glucozei și a perfuziei slabe a substanțelor în zona tumorii. S-a dovedit faptul că pH-ul acid stimulează invazia celulelor tumorale și formarea metastazelor in vitro și în celule, înainte de injecția în vena cavă in vivo. Studiul de față investighează dacă inhibarea acidității tumorale reduce incidența metastazelor in vivo. Aici arătăm că administrarea pe cale orală a NaHCO3 a crescut în mod selectiv pH-ul tumorilor și a redus formarea metastazelor spontane în cazul modelelor de cobai cu cancer de sân metastatic. Astfel, folosind spectroscopia de rezonanță magnetică, s-a dovedit faptul că acest tratament crește în mod semnificativ pH-ul extracelular, dar nu și pH-ul intracelular al tumorii; de asemenea, cu ajutorul microscopiei cu fluorescență s-a determinat producția de acid generat de către tumorile aflate în creștere. Terapia cu NaHCO3 a redus de asemenea rata complicațiilor la nivelul ganglionilor limfatici și, totuși, nu a afectat nivelurile celulelor tumorale circulante, acest fapt sugerând că metastazele reduse la nivelul organelor nu s-au datorat intravazării crescute. În contrast, terapia cu NaHCO3 a redus semnificativ formarea metastazelor hepatice dupa injecția intrasplenică, acest fapt sugerând că administrarea de NaHCO3 a inhibat extravazarea și colonizarea. În cazul injecțiilor în vena cavă în modelele alternative de cancer, bicarbonatul a dat rezultate mixte, inhibând formarea metastazelor în cazul celulelor de cancer de prostată PC3M, dar neavând niciun rezultat în ceea ce privește formarea metastazelor provenite din celulele de melanom B16. Deși mecanismul acestei terapii nu este cunoscut cu acuratețe, totuși, s-a arătat faptul că pH-ul scăzut conduce la creșterea eliberării de catepsina B activă, o protează importantă în remodelarea țesuturilor.
Introducere
pH-ul extracelular (pHe) al tumorilor maligne solide este acid, cu aciditatea cuprinsă între 6,5 și 6,9, în vreme ce pHe țesuturilor normale este în mod semnificativ mai alcalin, între 7,2 și 7,5. Modelele matematice ale interfeței tumoare-țesut gazdă și măsurătorile in vivo au arătat că tumorile solide exportă acid în parenchimul înconjurător. Studiile in vitro anterioare au arătat că invazia celulelor tumorale poate fi stimulată de condiții de mediu acide și că aceasta poate implica proteazele lizozomale. Aceste observații au condus la “ipoteza invaziei mediată de starea acidă”, unde se presupune că acidul produs de tumoră facilitează invazia tumorală prin promovarea morții celulelor normale și prin degradarea matricei extracelulare a parenchimului care înconjoară tumorile aflate în creștere. Mai mult tratarea în prealabil a celulelor tumorale cu acid înainte de injecție a condus la creșterea numărului de metastaze în cadrul experimentului și, astfel, aceste observații sugerează că pH-ul scăzut este într-o strânsă legătură cu invazia și cu supraviețuirea celulelor tumorale. S-a dovedit faptul că cancerele metastatice sunt caracterizate de abilitatea lor de a produce acid, produs secundar al metabolismului glucozei și, un aspect demn de notat, consumul crescut de fluorodeoxiglucoză de către cancerele mai agresive a fost observat cu ajutorul tomografiei cu emisie de pozitroni.
Studiul de față testează ipoteza că neutralizarea pH-ului acid tumoral va inhiba invazia și, deci, va reduce incidența metastazelor spontane. pH-ul acid a fost inhibat prin administrarea orală de NaHCO3, care s-a dovedit anterior că ridică pH-ul tumoral și nu afectează pHe țesuturilor normale. Acest fapt a fost confirmat în studiul de față. De notat că bicarbonatul nu a afectat pH-ul sistemic sau rata de creștere a tumorilor primare, dar a avut efecte semnificative asupra formării metastazelor spontane. În două din cele trei experimente, terapia cu NaHCO3 a redus colonizarea ganglionilor limfatici, dar în niciun experiment nu a afectat în mod semnificativ nivelurile celulelor tumorale circulante. În ciuda rezultatelor privitoare la ganglionii limfatici, aceste rezultate indică faptul că inhibiția metastazelor terminale la organe nu a avut loc printr-o reducere a intravazării. În contrast, formarea metastazelor la ficat după injecția intrasplenică cu celule MDA-MB-231 a fost semnificativ mai redusă, indicând faptul că colonizarea cu metastaze a fost afectată de terapia cu NaHCO3. În mod similar, metastazele care s-au dezvoltat după injecția în vena cavă cu celule de cancer de prostată PC3M au fost, de asemenea, inhibate după tratamentul cu bicarbonat, însă în cazul celulelor de melanom B16, metastazele nu au fost inhibate. Investigațiile preliminare în ceea ce privește mecanismele posibile de acțiune au arătat că eliberarea de catepsina activă B în spațiul pericelular a fost semnificativ crescută de condițiile de mediu acide și, astfel, terapia cu NaHCO3 poate acționa pentru a inhiba eliberarea acestei proteaze importante în remodelarea țesuturilor.
Materiale și Metode
Colorarea cu beta-galactozidază
Țesutul pulmonar recoltat a fost secționat în bucăți de 1 mm care au fost plasate în 2 mmol/L MgCl2 cu PBS, într-un mediu răcit cu gheață. Părțile secționate au fost fixate în 0,5% glutaraldehidă în Mg-PBS răcit cu gheață timp de 30 minute și apoi au fost spălate în PBS pentru a îndepărta fixativul rezidual. Părțile secționate fixate au fost apoi incubate timp de 3 ore la 37°C în reactiv tampon 5-bromo-4-cloro-3-indolil-beta-d-galactopiranozidă (35 mmol/L ferocianură de potasiu, 2mmol/L MgCl2, 0,02% NP40 și 0,01% Na deoxicolat în PBS). După incubație, secțiunile de țesut au fost spălate și păstrate în PBS, fiind analizate cu un microscop pentru disecție Stereomaster 4× (Fischer Scientific) cu o cameră digitală DC290 ZOOM (Eastman Kodak Company). Imaginile au fost preluate în același plan focal cu un timp de expunere de 1/10 s pentru lumina albă. Leziunile colorate cu beta-galactozidază au fost măsurate și numărate manual de către un observator care nu știa despre experiment.
Injecțiile intrasplenice
Celululele MDA-MB-231 (5 × 105) au fost injectate în splina cobailor SCID. La trei zile după injecție, cobaii au fost impărțiți aleatoriu în grupuri de control și de tratament cu bicarbonat. La 25 de zile după injecție, splina și ficatul cobailor au fost colectate și plasate în plăci cu 12 godeuri sterile cu fundul transparent. Imaginile acestor organe au fost obținute cu ajutorul luciferazei, folosind o cameră foto VersArray 1300B (Roper Scientific), cu expuneri la 10 minute, f2.2. Imaginile au fost analizate cu ImageJ. După preluarea de imagini, organele prelevate au fost omogenizate într-o soluție tampon (Promega) cu cinci faze, într-un omogenizator Dounce, adăugându-se apoi un volum de soluție tampon pentru dizolvarea celulelor (Promega). Soluția rezultată a fost amestecată în raport de 1:1 cu soluție de luciferază (Promega) și emisia de lumină a fost determinată folosind un aparat Wallac Victor (Perkin-Elmer).
Intravazarea
Primul pas în răspândirea metastatică implică mișcarea celulelor canceroase din locul primar în sânge (intravazare), fie direct, fie indirect, prin sistemul limfatic. Determinarea celulelor MDA-MB-231/eGFP în sângele cobailor SCID cu tumori a fost făcută cu ajutorul a trei metode în cadrul a două experimente separate. Într-un experiment (113007), animalele netratate (n=3) și cele tratate cu 200 mmol/L bicarbonat (n=7), având tumori primare, au fost eutanasiate dupa 36 zile de creștere a tumorii. În acest punct, dimensiunea medie a tumorii era de 463 ± 33,5 mm3 la ambele grupuri. Sângele a fost extras prin puncție cardiacă și amestecat cu un volum egal de 100 mmol/L EDTA pentru a preveni coagularea.
Un volum de sânge de 10 µL a fost întins pe lamele de sticlă și uscat. Celulele de culoare verde fluorescent au fost numărate manual cu ajutorul unui microscop cu fluorescență, cu zoom ×40. Celulele nucleate din volumul de sânge rămas (~ 300 µL) au fost obținute prin centrifugare cu Histopaque (Sigma) și celulele rezultate au fost resuspendate într-o placă cu 96 de godeuri în 100 µL de PBS și măsurate cu un aparat Victor cu lungimea de undă excitatoare stabilită la 485 nm și emisia la 535 nm. Într-un alt experiment, sângele din cobaii netratați și din cei tratați cu bicarbonat (n=8 din fiecare) a fost extras prin puncție cardiacă folosind aceleași metode ca mai sus. Dimensiunea medie a tumorii a fost de 121,8 ± 16,4 mm3. RBC au fost dizolvate cu o soluție specială pentru sortarea celulelor cu ajutorul florescenței (BD Sciences) conform instrucțiunilor producătorului. Celulele au fost tratate cu substanță de contrast LDS-751 pentru colorarea acizilor nucleici și au fost analizate cu ajutorul citometriei în flux cu un aparat FACScan (BD Biosciences) cu un laser cu argon de 488 nm. LDS-751 emite la 670 nm la excitația cu 488 nm și este detectabilă cu un detector de fluorescență. Fluorescența nespecifică a fost diferențiată de proteinele verzi fluorescente (GFP).
Activitatea catepsinei B
Măsurătorile făcute asupra catepsinei B au fost realizate în cadrul unui test “în timp real”, cum a fost descris de Linebaugh și de colegi. Pe scurt, celulele au fost expuse unui substrat fluorogenic (Z-Arg-Arg-NHMec) într-un sistem închis care a monitorizat rata formării produsului fluorescent (NH2Mec). Celulele MDA-MB-231 au fost crescute pe lamele, spălate cu soluție NaCl/Pi de la Dulbecco și echilibrate într-o soluție tampon fără substrat la 37°C pentru 5 minute. Măsurătorile au constat în: (a) un standard de fluorescență pentru soluția tampon conținând 100 µmol/L substrat Z-Arg-Arg-NHMec, timp de 5 minute; (b) rata formării produsului fluorescent datorită introducerii celulelor, urmărită timp de 10 minute; (c) rata formării produsului fluorescent, urmărită timp de 10 minute după îndepărtarea celulelor din cuva; și (d) rata formării produsului fluorescent atunci când celulele sunt plasate din nou în cuvă și membrana celulară este permeabilizată prin adăugarea de 0,1% (v/v) Triton X-100. Activitatea catepsinei B a fost măsurată după echilibrarea celulelor într-un mediu conținând 25 mmol/L PIPES cu pH 6,8 și 7,4 timp de 3 zile, urmând o incubație peste noapte în 0,2% FBS cu valorile de pH respective. Un inhibitor al catepsinei B, CA074, a fost adăugat în concentrația finală de 10 µmol/L pentru a confirma că activitatea măsurată s-a datorat catepsinei B. Măsurătorile au fost înregistrate cu ajutorul unui spectrofluorometru Shimadzu RF-450, cu excitație la 380 nm și emisie la 460 nm, echipat cu o cuvă cu control de temperatură, cu microagitator și un dispozitiv de înregistrare DR-3. După obținerea datelor, conținutul de AND de pe fiecare lamelă de sticlă a fost determinat prin măsurarea fluorescenței, folosind un colorant pentru acizii nucleici SYBR Verde I (Molecular Probes), cu 485 nm excitație și 535 nm emisie. Concentrațiile au fost calculate pe baza curbei standard a ADN-ului din sperma de somon. Rata formării produsului a fost exprimată ca picomoli pe minut pe microgram de ADN.
Date statistice
Toate calculele statistice au fost făcute cu ajutorul programului Prism versiunea 4.03 pentru Windows (GraphPad Software) sau Microsoft Excel.
Rezultate și discuție
În cadrul experimentelor inițiale, celulele de adenocarcinom MDA-MB-231 au fost injectate la nivelul mamar al cobailor femelă SCID. La șase zile după injecție, cobaii au fost împărțiți aleatoriu în două grupuri: unui grup (grupul de control) i s-a administrat apă de băut și celuilalt grup (grupul tratat cu bicarbonat) i s-a administrat 200 mmol/L NaHCO3 la discreție, fapt care a continuat pentru toată durata experimentului. Terapia cu bicarbonat nu a avut niciun efect asupra greutății animalelor și nici asupra ratelor de creștere a tumorilor primare. Lipsa efectelor asupra greutății corporale a animalelor (P=0,98) indică faptul că această terapie nu conduce la deshidratare deoarece deshidratarea provoacă rapid scăderea semnificativă în greutate la cobaii folosiți în experimente. Cobaii tratați cu bicarbonat au băut, în medie, 4,2 ± 0,2 ml de apă pe zi, în vreme ce cobaii din grupul de control au consumat 3,3 ± 0,1 ml apă/zi. Doza zilnică de bicarbonat absorbit a fost stabilită a fi astfel 36 ± 1,7 mmol/kg/zi (9,4 g/m2/zi). O doză echivalentă la un om de 70 de kg ar fi de 12,5 g/zi. Este de notat lipsa oricărui efect asupra creșterii tumorilor primare (P=0,8). Deși bicarbonatul a crescut efectiv pHe acestor tumori mari, totuși el nu a afectat pH-ul intracelular (pHi), după cum a reieșit din măsurătoarea MRS și acest fapt poate fi reflectat într-o lipsă de efect asupra ratelor de creștere a tumorilor.
În ciuda lipsei de efect asupra creșterii tumorilor primare, terapia cu bicarbonat a condus la reducerea semnificativă a numărului și a dimensiunilor metastazelor la nivelul plămânilor, intestinelor și la nivelul diafragmei. În experimentul de 30 de zile, datele rezultate au arătat că cobaii tratați cu bicarbonat au prezentat un total de 147 leziuni metastatice la nivel pulmonar, în vreme ce grupul de control au prezentat un total de 326 leziuni la nivel pulmonar (P=0,03). Diametrele medii ale leziunilor (± SE) au fost 4,5 ± 0,12 si 5,2 ± 0,14 mm în grupul tratat cu NaHCO3, respectiv, în grupul de control (P<0,0001). În cadrul experimentului de 60 de zile (n=20 și 15 pentru grupurile de control, respectiv, pentru grupul tratat cu NaHCO3), a fost determinat numărul de pixeli asociați cu leziunile >60 µm în diametru. Numărul mediu de pixeli corespunzători leziunilor per animal în grupul de control, și în grupul tratat cu NaHCO3 a fost de 382 și, respectiv, 74 (P=0,0004). Niciunul dintre animalele tratate cu NaHCO3 nu a prezentat o leziune mai mare de 240 de pixeli per animal, în vreme ce 10 din cele 20 de animale din grupul de control au avut leziuni mai mari de 240 de pixeli per animal. Ambele experimente au arătat un număr semnificativ mai redus de leziuni în cazul grupului tratat cu bicarbonat, decât în cazul grupului de control.
Această reducere a metastazelor a condus, de asemenea, la o creștere a ratei de supraviețuire. După necropsie, grupul de control a prezentat leziuni pulmonare semnificative, evidențiate prin fluorescență, în vreme ce grupul tratat cu bicarbonat a prezentat doar o vagă fluorescență. Aceste date au fost cuantificate și pentru celelalte zone metastatice în cazul tuturor animalelor și au evidențiat scăderea în frecvența și în densitatea fluorescenței la nivelul organelor viscerale (intestine, pancreas, ficat, splină, vezică urinară); de asemenea, datele au fost cuantificate pentru metastazele mezenterice în cazul grupurilor tratate cu bicarbonat. Aceste date sunt notabile prin aceea că efectul terapiei cu bicarbonat a fost mai mare decât în oricare alte experimente anterioare și totuși vârsta medie de sacrificare a fost >100 zile atât pentru grupul de control, cât și pentru grupul tratat cu bicarbonat (adică a fost semnificativ mai mare decât vârstele de sacrificare din experimentele anterioare).
Deși s-a arătat anterior că administrarea pe cale orală un timp îndelungat a NaHCO3 poate conduce la neutralizarea acidozei tumorale, acest fapt a fost confirmat aici în cazul modelului tumoral MDA-MB-231, folosind analiza 31P MRS în cazul animalelor cu tumori, după 3 săptămâni de terapie (4 săptămâni după inocularea cu tumoare). pHi a fost măsurat cu ajutorul frecvenței de rezonanță a fosfatului anorganic și pHe a fost măsurat cu ajutorul indicatorului pH exogen 3-amino propilfosfonat. Spectrul 31P al tumorilor tratate cu NaHCO3 a prezentat schimbări semnificative în frecvența de rezonanță a substanței active (3-amino propilfosfonat), cu o schimbare mică sau chiar fără nicio schimbare în frecvența fosfatului anorganic. Valorile medii ale pHe au fost de 7,4 ± 0,06 în cazul tumorilor tratate cu NaHCO3, comparativ cu pH 7 ± 0,11 în cazul grupului de control. Este notabil faptul că pHi al tumorilor a rămas neafectat, fiind 7 ± 0,06 si 7,1 ± 0,09 în cazul grupului de tratament și, respectiv, de control. pHi și pHe au fost, de asemenea, măsurați în cazul țesuturilor netumorale în cazul acelorași animale, cu observația că pHi și pHe au fost neafectate de bicarbonat, fiind 7,22 ± 0,04 și 7,40 ± 0,08, respectiv, în ambele grupuri, fapt care este în acord cu rezultatele precedente.
În ciuda efectelor semnificative asupra formării metastazelor și asupra pHe tumoral, terapia pe termen lung cu bicarbonat nu a avut niciun efect asupra chimismului sângelui, indicând faptul că pH-ul sistemic a fost complet compensat în aceste animale. Astfel, după cum ne-am așteptat, tratamentul îndelungat cu NaHCO3 nu a condus la alcaloza metabolică sistemică. Mai degrabă, am emis ipoteza că inhibarea metastazelor tumorale s-a datorat neutralizării crescute cu bicarbonat a fluidului interstițial al tumorilor primare sau al metastazelor. Astfel, nivelurile de bicarbonat din tumori au fost crescute pentru a fi în armonie cu restul corpului, conducând la o creștere selectivă a pHe tumoral. Acest efect a fost modelat folosind modelarea kineticii reacției de difuzie și a arătat că (a) în fața unui mediu acid ridicat, provenit din celulele tumorale hipermetabolice, efectul bicarbonatului va fi incomplet chiar și la concentrația de 200 mmol/L; (b) soluții tampon cu un pKa mai înalt pot fi mult mai eficiente. În acord cu aceste predicții, un experiment doză-răspuns de 30 de zile a dovedit faptul că concentrații joase de 50 mmol/L au redus incidența metastazelor spontane; totuși efectul cel mai mare a fost observat la doza cea mai mare investigată, de 200 mmol/L, indicând faptul că, chiar și la această doză, de 200 mmol/L, efectul neutralizării acidității tumorale este incomplet. Lipsa unui efect complet a fost investigată ulterior prin inocularea unor cobai (n=3 per grup) cu celule tumorale MDA-MB-231 transfectate GFP. Ca mai sus, administrarea ad libitum a 200 mmol/L NaHCO3 a început la 6 zile după inoculare. După o săptămână și după două săptămâni de terapie, pHe a fost măsurat. Astfel, pHe este mai acid în cazul tumorilor de control și această aciditate se extinde dincolo de granițele tumorii, în vreme ce regiunile cu pHe acid în cazul cobailor tratați cu bicarbonat au fost limitate la volumul tumorii. În vreme ce pHe intratumoral nu a fost afectat semnificativ în cazul grupului tratat cu bicarbonat (P=0,19), pHe peritumoral, măsurat la 0,2 mm de granița tumorală, a fost semnificativ mai ridicat în cazul grupului de cobai tratați cu bicarbonat, comparativ cu grupul de control (P=0,05). Astfel, atât fluorescența, cât și analiza MRS au evidențiat valori mai ridicate ale pHe tumoral în cazul grupurilor de cobai tratați cu bicarbonat, deși analiza MRS a evidențiat un efect mai mare. Aceste diferențe aparente se pot datora modalităților diferite de investigare, precum măsurătorile efectuate prin două tehnici diferite (MRS și fluorescența) în două sisteme diferite (ortotopic și heterotopic), fiind vorba și despre două perioade diferite de tratament (21 zile și 7 zile). Analizele efectuate 7 zile mai târziu au arătat faptul că modificările în ceea ce privește diametrele tumorilor nu au fost diferite semnificativ între cele două grupuri, dar au fost diferențe semnificative (P=0,002) în ceea ce privește densitățile tumorilor. Astfel, densitățile au crescut cu timpul și cazul grupului de control și au scăzut cu timpul în cazul tumorilor tratate cu bicarbonat. În vreme ce importanța acestor observații nu este clară, totuși ele pot conduce la o aplicație practică. Densitățile celulelor tumorale pot fi măsurate pe cale noninvazivă, cu ajutorul rezonanței magnetice și, deci, această modalitate poate fi utilă ca biomarker cantitativ pentru efectele terapiei cu bicarbonat in vivo.
Analiza cantitativă a intravazării, extravazării și a pH-ului
Pentru a începe investigarea mecanismului prin care bicarbonatul de sodiu produce efectele terapeutice au fost concepute experimente care să separe clar evenimentele timpurii (intravazarea) de evenimentele târzii (extravazarea și colonizarea) ce caracterizează metastazele spontane. Aceste metastaze spontane apar prin mișcarea celulelor tumorale din zona tumorii primare în sânge (intravazare), fie direct sau indirect, pe calea limfatică. În xenografturi, acest lucru poate implica invazia activă locală sau un proces pasiv de vărsare. După intravazare, celulele tumorale circulante se depun și colonizează locurile distante. Există unele controverse dacă aceasta are loc prin simpla depunere a celulelor tumorale circulante în vasele de dimensiuni mici (determinând ischemie locală) sau dacă implică interacțiunea specifică a celulelor tumorale circulante cu endoteliul post-capilar, urmată de extravazare. Pentru a investiga efectul terapiei cu bicarbonat asupra intravazării, au fost cuantificate incidentele implicării limfatice și ale celulelor tumorale circulante. Astfel, a fost analizată situația ganglionilor limfatici în cazul cobailor SCID inoculați cu celule tumorale MDA-MB-231 GFP, care au fost împărțiți aleatoriu într-un grup de control (n=12) și un grup tratat cu bicarbonat (n=11). Tumorile primare au crescut timp de 40 de zile (la volume de 800-1000 mm3), moment în care animalele au fost sacrificate și ganglionii limfatici și alte organe au fost examinate prin imagerie fluorescentă. Pentru evaluare, ganglionii limfatici ce prezentau doar câteva colonii fluorescente de celule cancerigene au fost caracterizați ca fiind “urme”, iar aceia în cazul cărora întregul ganglion era inflamat au fost caracterizați ca fiind “pozitivi”. Analizele arată că în majoritatea cazurilor a fost vorba despre o implicație a ganglionilor limfatici, animalele tratate cu NaHCO3 fiind mai puțin afectate. Majoritatea acestora (9 din 12) au prezentat doar urme de fluorescență la nivelul ganglionilor limfatici, în vreme ce 7 din 11 animale din grupul de control au prezentat ganglioni pozitivi și/sau metastaze (P=0,044, Mann-Whitney-Wilcoxon). În mod similar, implicarea ganglionilor limfatici în studiul de supraviețuire a arătat un efect mai semnificativ asupra dezvoltării metastazelor la nivelul ganglionilor limfatici, până la volume >300 mm3. Pentru testarea și mai aprofundată a intravazării, celulele tumorale circulante au fost determinate în sângele cobailor cu tumori, prin numărarea manuală, prin citometria în flux după hemoliza eritrocitelor și prin fluorescența extractelor din sânge. În cazul tuturor experimentelor a fost vorba despre un număr scăzut de celule tumorale circulante și nicio măsurătoare nu sugerează diferențe semnificative între grupul tratat cu bicarbonat și grupul de control. Din aceste date concluzionăm că, deși bicarbonatul poate avea un efect asupra colonizării mai reduse a ganglionilor limfatici, acest lucru nu conduce în mod clar la o creștere a numărului de celule tumorale circulante în cazul netratării cu bicarbonat, în ambele cazuri fiind vorba de un număr redus de celule tumorale circulante.
Efectul terapiei cu bicarbonat asupra extravazării a fost măsurat în două moduri. Datorită faptului că cancerul de sân de obicei conduce la formarea de metastaze la nivelul ficatului, pentru măsurarea extravazării a fost folosită incidența metastazelor descoperite în ficat la 21 de zile după injecția intrasplenică cu 104 celule MDA-MB-231 marcate cu luciferază. Astfel, nivelurile de luciferază în ficatul cobailor tratați cu bicarbonat au fost semnificativ mai mici decât acelea din ficatul cobailor din grupul de control. Așadar, terapia cu bicarbonat a avut un efect mult mai pronunțat asupra extravazării și colonizării, comparativ cu intravazarea. Caracterul general al acestui fenomen a fost examinat prin monitorizarea metastazelor produse dupa injecția în vena cavă a celulelor PC3M de cancer de prostată la om sau a celulelor de melanom B16, marcate cu luciferază. Imaginile cu luciferază preluate în cazul ambelor sisteme arată o diferență clară în sistemul PC3M și o lipsă clară de efect în sistemul B16. Progresia metastazelor în cazul sistemului PC3M a fost semnificativ diferită (P=0,04) la 35 de zile, între grupul tratat cu bicarbonat și grupul de control. De asemenea, trebuie notat că tumorile B16 au crescut mai repede, conducând la moartea animalelor după 17 zile, comparativ cu supraviețuirea mai mare de 42 de zile în cazul tumorilor PC3M. Astfel, fie aceste celule B16 colonizează independent de pH, fie rata de producere a acidului copleșește pur și simplu abilitatea bicarbonatului de a neutraliza pH-ul. Cu toate acestea, datele arată că cel puțin în cazul a două tipuri de cancer (MDA-MB-231 și PC3M), bicarbonatul reduce eficiența colonizării tumorale în zone distante.
Efectele bicarbonatului observate în cadrul acestui studiu este posibil să se fi exercitat fie în ceea ce privește tumora primară, fie în zonele metastatice, aceste aspecte fiind încă în curs de cercetare. Pe de o parte, este posibil ca pH-ul tumorei primare să inducă un răspuns la stres în aceste celule, conducând la o rată crescută de supraviețuire. Acest fapt ar fi în acord cu observațiile anterioare ale lui Hill și Rofstad care au arătat că tratamentul în prealabil al celulelor de melanom cu pH acid înainte de injectare conduce la o rată crescută de supraviețuire a celulelor în zonele metastatice. Pe de altă parte, este posibil ca neutralizarea pH-ului cu ajutorul bicrabonatului să inhibe invazia locală în zonele metastatice. Acest fapt a fost formulat ca ipoteza invaziei mediată de aciditate, unde acidul produs de tumoră este excretat în parenchimul înconjurător, conducând la degradarea matricei celulare înconjurătoare.
Fie că este vorba despre tumora primară sau despre zonele metastatice, pH-ul acid pare să stimuleze comportamentul invaziv și supraviețuirea crescută a celulelor de cancer, fie prin selecție, fie prin inducție. S-a arătat că pH-ul acid induce expresia și activitatea unui număr de sisteme implicate în remodelarea celulară matriceală. În plus, pH-ul scăzut poate stimula neoangiogeneza prin inducția factorului de creștere vascular endotelial sau interleukina-8, sau poate stimula invazia simplu prin inducerea apoptozei în celulele parenchimale, după cum am arătat anterior, selectând în același timp celulele tumorale care sunt rezistente la apoptoză. CD44 este asociată cu celulele de cancer la sân cu proprietăți asemănătoare celulelor stem și acestea sunt cunoscute ca fiind rezistente la apoptoza indusă în mediul în care se găsesc. Pentru a începe investigarea nenumăratelor mecanisme moleculare posibile, a fost analizată catepsina B în cazul celulelor MDA-MB-231 tratate cu acid și s-a observat că activitatea proteazei secretate în mediul înconjurător a crescut de până la 4 ori, fără niciun efect asupra activităților asociate celulelor. Astfel, se pare că pHe acid al tumorilor poate induce eliberarea acestei proteaze care este implicată în dinamica matricei extracelulare în cancerul de sân. Experimentele sunt în curs de desfășurare pentru a determina dacă terapia cu bicarbonat poate inhiba această activitate in vivo.
Concluzii
Datele de mai sus au arătat că terapia orală cu bicarbonat a redus semnificativ incidența metastazelor în modelele experimentale de cancer de sân și prostată și că efectul pare a fi în principal asupra proceselor distale (adică colonizarea), mai degrabă decât asupra proceselor proximale (adică intravazarea). Nu este cunoscut dacă bicarbonatul își exercită efectele prin descreșterea ratei de supraviețuire a celulelor tumorale circulante (deși numărul lor nu este afectat) sau prin inhibarea colonizării în zona metastatică. Creșterea pHe a redus semnificativ eliberarea proteazei lizozomale, catepsina B.
Din punct de vedere medical, ideea de a trata cancerul prin administrarea pe cale orală a unor soluții tampon este atractivă, dar sunt, totuși, rezerve. Modelele reacției difuzie arată că efectul bicarbonatului asupra gradientului pHe depinde de doză și că la doza curentă de 200 mmol/L nu apare saturația. Această doză înseamnă administrarea ~1,5 µmol/h/g în cazul cobailor. Prin comparație, rata producției de acid a tumorilor poate fi de ~100 µmol/h/g din greutatea tumorei. Astfel, aceste doze de NaHCO3 pot fi capabile să contracareze acidul produs de o tumoră de 15 mg, ceea ce înseamnă ~105 celule sau o micrometastază de 1 mm3. Eficiența acestei terapii va fi scăzută în cazul tumorilor mai mari. Este cumva surprinzător că acest efect incomplet poate avea un efect dramatic asupra metastazelor. O altă problemă este că bicarbonatul, cu un pKa efectiv de 6,24, pare mai puțin potrivit pentru o soluție tampon care să alcalinizeze; astfel, este posibil ca un control mai bun al pHe și efecte antimetastatice mai bune să fie observate cu o soluție tampon cu pKa mai ridicat. Totuși, e posibil ca acest efect să fie specific pentru soluții tampon din familia bicarbonatului/CO2 prin implicațiile activității anhidridei carbonice, care este importantă pentru regularizarea pH-ului la nivelul tumorilor. În ciuda acestor probleme, totuși, efectul dramatic al terapiei cu bicarbonat asupra formării metastazelor în cancerul de sân în acest sistem model justifică efectuarea unor cercetări ulterioare.
