Introducere

Ateroscleroza este o boală inflamatorie a peretelui arterial. Hipercolestrolemia, fumatul, sexul masculin, hipertensiunea, diabetul și înaintarea în vârstă sunt, în general, factori de risc pentru ateroscleroză. Totusi, cercetările recente, prin rezultatele obținute, sugerează că răspunsurile imunitare înnăscute și adaptative joacă un rol important în patogenezia aterosclerozei. În acest proces sunt implicate și interacționează celulele endoteliale, macrofagele, celulele mușchilor netezi și limfocitele. Ca urmare a interacțiunii acestor factori, se formează placa aterosclerotică care influențează procesul de hrănire al organelor și în final conduce la probleme cerebrovasculare și la sindroame coronariene acute. S-a dovedit că produsul celulelor T CD4+(IFN-?, IL-10, IL-4 etc.), numit citokina, influențează mărimea și natura plăcii aterosclerotice. Studiile referitoare la influența sistemului imunitar asupra aterosclerozei s-au bucurat de un interes crescut în ultimii ani, în special în ceea ce privește celulele de reglementare T naturale. Cercetările anterioare au arătat că celulele Th1 au fost în detrimentul procesului aterosclerotic și, de asemenea, că celulele Th2 sau celulele naturale T ucigașe au contribuit și ele la dezvoltarea aterosclerozei. Două citokine majore, contra-regulatoare, precum IL-10, și factorul beta de transformare a creșterii (TGF-?) sunt necesare pentru funcțiile imunoregulatoare ale celulelor Treg naturale sau a celor adaptative induse prin antigen, care joacă un rol important în progresia bolii aterosclerotice. În plus, s-a descoperit că regulatorul de transcripție Foxp3 controlează funcționarea celulelor Treg CD4+CD25+ la cobai. Astfel, este bine cunoscut faptul că celulele Treg joacă un rol protector în progresia aterosclerozei și aceste celule sunt considerate a fi o țintă terapeutică pentru tratamentul aterosclerozei.

Amigdalina (numită uneori și vitamina B17 sau laetril) este extrasă din sâmburii de piersică, sămânța copacului Prunus persica. De asemenea, amigdalina este prezentă în cantități semnificative în sâmburii de caise, în migdale și în semințele altor plante din familia Rozaceelor. Pe lângă activitatea antitumorală, amigdalina a fost utilizată, de asemenea, pentru tratamentul astmului, bronșitei, emfizemului, leprei și diabetului. Sămânța de piersică este o componentă majoră a decoctului chinezesc Xuefu Zhuyu, care este de ajutor în ateroscleroză, conform teoriei din medicina tradițională chineză și conform practicii clinice. Datorită faptului că amigdalina este componetul major în decoctul Xuefu Zhuyu, a apărut întrebarea dacă nu cumva s-ar putea ca amigdalina să aibă efecte antisclerotice in vivo. Este posibil ca tratamentul cu amigdalină să conducă la scaderea nivelurilor LDL, a nivelului de trigliceride și a nivelului de colesterol total la cobaii cu deficit de apolipoproteina E? În particular, deoarece amigdalina poate stimula sistemul imunitar și are cumva o funcție imunomodulatoare, este posibil, oare, ca funcționarea amigdalinei să se bazeze pe celulele Treg? Studiile au arătat că ateroscleroza coronară era asociată cu constricția coronară în timpul stimulării presoare la rece. Inflamația indusă cu ajutorul carrageenan-ului contribuie, de asemenea, la avansarea aterosclerozei. În medicina tradițională chineză, presorul la rece este numit, de asemenea, factorul rece, în vreme ce inflamația indusă cu ajutorul carrageenan-ului este numită factorul fierbinte. După ce s-au stabilit modelele aterosclerotice conform factorilor rece sau fierbinte, s-au administrat cobailor amigdalina, pentru a investiga efectul sau anti-aterosclerotic. Premiza de la care s-a plecat a fost că studiul influenței amigdalinei asupra mecanismului imunomodulator este posibil să elucideze funcția farmacologică a amigdalinei în ateroscleroză.

Materialele și metodele folosite

Animalele

Cobai masculi, în vârstă de 8 săptămâni, cumpărați de la Jackson Laboratories și ținuți într-un mediu cu 12 ore lumină/întuneric, având acces liber la hrană și apă.

Metodologia

Amigdalina a fost cumpărată de la Changsha Staherb Natural Ingredients Co., Ltd.

Cobaii masculi, în vârstă de 8 săptămâni, au fost repartizați în 6 grupe:

—Grupul de control, căruia i s-a administrat o dietă standard de laborator (10% grasimi, 15% proteine, 75% carbohidrați);

—Grupul de control cu deficit de apolipoproteină E, căruia i s-a administrat o dietă bogată în grăsimi (40% grăsimi, 14% proteine și 46% carbohidrați) timp de 12 săptămâni;

—Grupul de control rece, cobailor masculi, în vârstă de 8 săptămâni, cu deficit de apolipoproteina E li s-a administrat o dietă bogată în grăsimi (40% grăsimi, 14% proteine și 46% carbohidrați) timp de 12 săptămâni și, în fiecare zi, cobaii au fost ținuți timp de 2 ore la temperatura de -20°C;

—Grupul de control rece + amigdalină: cobaii cu ateroscleroză au fost clasificați ca formând grupul de control rece. Acestora li s-a injectat amigdalină (1 mg/kg) intraperitoneal;

—Grupul de control cald: cobailor masculi, în vârstă de 8 săptămâni, cu deficit de apolipoproteină E, li s-a administrat o dieta bogată în grăsimi (40% grasimi, 14% proteine si 46% carbohidrati) timp de 12 săptămâni și li s-a injectat carrageenan (5ml/kg, sigma) intraperitoneal;

—Grupul de control cald + amigdalină: cobaii cu ateroscleroză au fost clasificati ca formând grupul de control cald. Acestora li s-a injectat amigdalină (1 mg/kg) intraperitoneal.

Testele au fost realizate după 4 săptămâni de administrare a amigdalinei.

Profilul lipidelor și măsurătorile de citokină

Pentru măsurarea conținutului de colesterol, au fost colectate mostre de sânge la începutul și la sfârșitul tratamentului cu amigdalină. Nivelurile plasmatice de colesterol total și de trigliceride au fost determinate cu ajutorul kit-urilor comerciale (Appligen, Beijing, China). Nivelurile fatorului beta de transformare a cresterii TGF-? și ale interleukinei IL-10 au fost testate folosind kit-uri ELISA, utilizând anticorpi pereche, conform instrucțiunilor oferite de producător (R&D Systems, Minneapolis, Minn.)

Evaluarea aterosclerozei la nivelul sinusului aortic

Inimile și secțiunile superioare ale aortei au fost extrase, fixate și secționate. Leziunile aterosclerotice au fost cuantificate prin evaluarea dimensiunii leziunii aterosclerotice la nivelul sinusului aortic. Zonele secționate au fost colorate cu hematoxilină si eozină și suprafața vaselor de sânge a fost măsurată cu ajutorul ImageJ software (NIH), folosind imaginile obținute cu microscopul Nikon 80i. Pentru compararea zonelor cu placa aterosclerotică în cazul grupurilor tratate cu amigdalină și a grupurilor de control, s-au folosit zone situate la 100 si 200 µm de sinusul aortic.

Imunohistochimia (IHC)

Pentru colorarea imunohistochimică au fost utilizate secțiuni seriale fixate în parafină, efectuate la 100 si 200 µm distanță de sinusul aortic. Kit-ul TUNEL (Roche) a fost folosit pentru a testa procentul de apoptoză. Lamelele cu probele supuse analizei au fost colorate cu soluția de contrast DAPI (sigma). Au fost examinate cel puțin patru secțiuni per cobai pentru fiecare imunocolorare și au fost utilizate controale negative potrivite.

Analiza vestică a sugativei în cazul proteinei FOXP3

Celule T de la nivelul splinei au fost izolate de la cobaii din cadrul fiecarui grup. A fost realizată analiza sugativei.

Analiza PCR în timp real

RNA-ul total de la splenocite și limfocite a fost izolat, folosind reactivul Trizol (Invitrogen); au fost aleși primeri oligonucleotidici. Analiza PCR în timp real a fost realizată cu un sistem ABI 7900.

Separarea celulelor și citometria în flux

Pentru analiza sortării celulelor activate fluorescent (FACS) a fost folosit kit-ul pentru colorarea celulelor regulatoare T la cobai (Becton-Dickinson). Celulele marcate prin colorare au fost analizate cu un citometru de flux FACScan cu ajutorul software-ului CellQuest (Becton-Dickinson).

Analiza statistică

Efectele tratamentului în zonele afectate de ateroscleroză, compoziția plăcii aterosclerotice, nivelurile de interleukină IL-10 și TGF-?, nivelurile de mARN și procentele TUNEL au fost calculate cu ajutorul testului ANOVA și Bonferroni/Dunn. O valoare a lui p<0,05 a fost considerată semnificativă din punct de vedere statistic.

Rezultate

Nivele scazute de lipide la nivelul sângelui, induse de amigdalină

Judecând după schimbările cantitative ale lipidelor din sânge (trigliceridele și colesterolul total), ateroscleroza la nivelul sinusului aortic a crescut în cazul dietei prelungite bogată în grăsimi la cobaii cu deficiență de apoplipoproteină E. Oricum, situația a fost exacerbată, atunci când cobaii au fost supuși factorului rece sau fierbinte. Astfel, trigliceridele au crescut de 7-8 ori față de grupul de control normal hrănit cu o dietă normală. Colesterolul total a crescut de 9-10 ori. Pentru a evalua efectul anti-aterosclerotic al amigdalinei, nivelurile de trigliceride și de colesterol total au fost comparate între grupurile carora li s-a administrat amigdalina și grupurile de control corespunzătoare. S-a descoperit faptul că cobaii tratați cu amigdalină au prezentat niveluri mai scăzute de trigliceride și de colesterol total (p<0,05). Între timp, tratamentul cu amigdalină a putut să scadă, de asemenea, și nivelurile de LDL-c (p<0,05). Totuși, factorul rece și fierbinte nu a influențat asupra lipoproteinelor cu densitate mare (HDL-c), comparativ cu cobaii cu deficiență de apolipoproteină E (p>0,05). Astfel, tratamentul cu amigdalină nu a indus un nivel scăzut de HDL-c (p>0,05).

Dezvoltarea întârziată a aterosclerozei

Pentru a investiga mai în amănunțime transformările patologice în cazul tratamentului cu amigdalină în prezența factorilor rece și fierbinte, au fost analizate zonele vaselor sanguine, ale lumenului și ale plăcii aterosclerotice. Odată cu progresarea aterosclerozei, diametrul sinusului aortic a crescut cu timpul, creștere însoțită de o scădere a suprafeței lumenului și o creștere a suprafeței plăcilor aterosclerotice. Așadar, atât factorul rece, cât și factorul fierbinte favorizează dezvoltarea  aterosclerozei. Pe de alta parte, cobaii cărora li s-a administrat amigdalină au prezentat o suprafață semnificativ mai redusă afectată de ateroscleroză, aspect evidențiat prin plăci aterosclerotice mai mici la nivelul sinusului aortic, printr-un sinus aortic mai puțin mărit și prin suprafețe mai mari ale lumenului, comparativ cu cele prezente în cazul cobailor cu apolipoproteina E, supuși factorului rece sau fierbinte.

Inhibarea avansării aterosclerozei prin inducerea citokinelor asociate celulelor Treg

Pentru a urmări dacă prezența celulelor Treg este asociată sau nu cu o schimbare în administrarea amigdalinei în ateroscleroza din cazul cobailor cu apolipoproteina E aflați sub influența factorului rece sau fierbinte, a fost comparată abundența citokinelor din sânge, aflate în legătură cu celulele Treg. Au fost luate mostre de ser de la cobaii tratați și de la cei netratați cu amigdalină și au fost analizate prin căutarea prezenței citokinelor IL-10 și TGF-beta, ambele fiind esențiale pentru funcția imunoregulatoare a celulelor Treg. Astfel, nivelurile de IL-10 erau crescute după administrarea amigdalinei. TGF-? este necesară pentru întreținerea periferică a celulelor Treg și mediază funcția lor supresoare in vivo. S-a descoperit că nivelurile de TGF-? erau, de asemenea, semnificativ crescute în cazul grupurilor tratate cu amigdalină. Abundența mare de citokine IL-10 și TGF-beta sugerează că funcția anti-aterosclerotică a amigdalinei este în legătură cu celulele Treg.

Inducția celulelor Tregs prin factorul Foxp3+

Deoarece factorul de transcripție Foxp3+ este exprimat specific în celulele Tregs, care controlează hoimeostazia celulelor T prin suprimarea atât a celulelor Th1, cât și a celulelor Th2 față de răspunsurile imunitare patogene, este posibil ca efectul anti-aterosclerotic al amigdalinei să fie mediat de celulele Treg Foxp3pozitive. Inițial, a fost măsurat procentajul de celule T CD4+CD25+ în totalul populației de CD4 prin analiza FACS și s-a descoperit că numărul celulelor T activate era semnificativ crescut în cazul cobailor tratați cu amigdalină, comparativ cu cobaii netratați (p<0,05). Apoi s-a făcut o dublă colorare pentru CD25 și Foxp3. Astfel, grupurile tratate cu amigdalină au prezentat mai multe celule CD25 și Foxp3 dublu pozitive, comparativ cu grupurile netratate (p<0,05). Pentru a analiza mai departe influența amigdalinei asupra celulelor Treg, au fost investigate nivelurile Foxp3 de mARN și nivelurile de proteine în splenocite și în celulele sanguine periferice. Astfel, s-a descoperit o creștere semnificativă a nivelului de proteină Foxp3 în grupurile tratate cu amigdalină. Prin cuantificarea nivelurilor Foxp3 de mARN, s-a descoperit o creștere de 4,3 ori (rece) și de 4,9 ori (fierbinte) a nivelurilor Foxp3 de mARN în splenocite și o creștere de 3,8 ori (rece) și de 5 ori (fierbinte) a nivelurilor Foxp3 de mARN în cazul celulelor sanguine periferice la grupurile tratate cu amigdalină, comparativ cu grupurile netratate (p<0,05).

Inducția apoptozei

Pentru a stabili rolul amigdalinei în avansarea aterosclerozei, a fost făcută colorarea TUNEL pentru a măsura procentajul apoptotic în cazul leziunilor aterosclerotice. Studiile publicate recent evidențiază implicarea funcțională a granzimei B și a apoptozei în cazul funcției imunosupresoare a celulelor Treg. Pentru a vedea dacă ratele apoptozei contribuie la efectul anti-aterosclerotic observat în tratamentul cu amigdalină, a fost analizat procentul de fragmentării ADN-ului în cazul leziunilor aterosclerotice la cobaii tratați și netratați. Astfel, s-au observat procentaje semnificativ mai mari de celule apoptotice în cazul leziunilor aterosclerotice prezente la cobaii tratați cu amigdalină, comparativ cu cobaii din grupul de control (p<0,01). Astfel, s-a emis presupunerea că funcția anti-aterosclerotică a amigdalinei a contribuit la apoptoza indusă prin celulele Treg.
Este bine cunoscut că celulele Treg joacă un rol important în dezvoltarea aterosclerozei, aspect dovedit prin studiile asupra transferului adoptiv al limfocitelor și al citokinelor Th2 produse de celulele Treg. În prezentul material s-a dovedit funcția anti-aterosclerotică a amigdalinei prin inducerea cu succes a apariției celulelor Treg in vivo. Deși amigdalina are o funcție controversată în tratamentul cancerului, se pare că amigdalina joacă un rol eminamente pozitiv în tratamentul aterosclerozei. Comparate prin măsurarea nivelurilor de colesterol din sânge, lipidele din sânge au fost semnificativ scăzute după tratamentul cu amigdalină. Apoi a apărut întrebarea despre ce anume a cauzat schimbarea nivelului de lipide în sânge la cobaii tratați cu amigdalină. Au fost, de asemenea, studiate leziunile aterosclerotice. Datele statistice referitoare la sinusul aortic, la suprafețele lumenului, la suprafețele cu placă ateroscleoritcă și la procentul de acoperire cu placă aterosclerotică a aortei au ilustrat schimbările patologice la nivelul aortei în cazul cobailor cu ateroscleroză. Ceea ce este interesant nu este doar funcția farmacologică a amigdalinei în ateroscleroză, ci și mecanismul prin care tratamentul cu amigdalină atenuează simptomele în ateroscleroză. Această boală este provocată de un dezechilibru între celulele T și celulele Treg, care suprimă răspunsul imunitar exagerat la autoantigen. Datorită faptului că studiile recente au subliniat rolul celulelor Treg în avansarea aterosclerozei, s-a acordat o atenţie sporită strategiilor pentru inducerea celulelor Treg CD4+CD25+Foxp3+ in vivo. Steffen şi ceilalţi au raportat că tratamentul cu anticorpul anti-CD3 ar putea induce o leziune aterosclerotică semnificativ mai redusă în ceea ce privește suprafața plăcii și acest fapt a fost asociat cu inducția de TGF-β în ganglionii limfatici și cu manifestarea factorului Foxp3 la nivelul splenocitelor și al celulelor sanguine periferice. Van Piujvelde și ceilalți au demonstrat că administrarea orală de oxLDL poate induce ateroscleroză atenuată în cobaii cu ldlr-|-. Celulele Treg CD4+CD25+Foxp3+ au fost descoperite, de asemenea, în splina și în nodulii limfatici mezenterici în cazul cobailor cu ldlr-|-. Totuși, deoarece antiocorpul anti-CD3 este un agent imunosupresor folosit în practica medicală pentru inducerea toleranței după transplant, pacienții cărora li s-a administrat acest aticorp prezintă riscul de a face o boală infecțioasă. În ceea ce privește tratamentul cu amigdalină, acesta a indus cu succes celulele Treg CD4+CD25+Foxp3+, fapt confirmat de nivelurile secreției de citokină și de nivelurile Foxp3 mARN. S-a descoperit că cobaii tratați cu amigdalină au niveluri mai crescute de TGF-β. TGF-β este o citokină necesară pentru menținerea periferică a celulelor naturale Treg și, in vivo, funcția imunosupresoare a celulelor Treg depinde de TGF-β. Așadar, a fost testată ipoteza că funcția anti-aterosclerotică a amigdalinei este în legătură cu celulele Treg. Nivelurile de TGF-β și de IL-10 au fost crescute după tratamentul cu amigdalină, fapt care se datorează în principal creșterii numărului de celule Treg CD4+CD25+Foxp3+. Prin testarea numărului de celule CD4+CD25+ și Foxp3+ la nivelul splinei și al celulelor sanguine periferice, s-a descoperit că cobaii care nu au primit tratament cu amigdalină prezentau un număr semnificativ mai redus de celule Treg la nivelul splinei și la nivelul sângelui. Astfel, s-a emis ipoteza că tratamentul cu amigdalină ar putea ameliora ateroscleroza și ar putea întârzia avansarea leziunilor prin inducerea celulelor Treg.
 
S-a arătat că Foxp3+ guvernează dezvoltarea și funcțiile celulelor Treg. Mutațiile la nivelul Foxp3+ vor elimina celulele Treg CD25+, provocând probleme autoimune. Astfel, s-a realizat un studiu asupra nivelurilor Foxp3+ mARN și asupra nivelului de expresie Foxp3+. S-a cercetat dacă funcția amigdalinei de inducție a apariției celulelor Treg este asociată cu Foxp3+. Prin cuantificarea nivelurilor Foxp3+ mARN și a nivelurilor de proteine, s-a descoperit că amigdalina poate induce transcripția și translația genetică Foxp3+ și, astfel, poate induce dezvoltarea celulelor Treg. Aceste descoperiri sugerează că amigdalina poate fi asociată cauzal cu creșterea numărului de celule Treg. Totuși, nu s-a elucidat încă mecanismul precis prin care celulele Treg mediază funcția imunosupresoare și dacă semnalele costimulatoare sunt implicate și ele în acest proces.
 
Dincolo de studierea mecanismului prin care amigdalina este implicată în apariția celulelor Treg și de studiul farmacologic asupra aterosclerozei, s-a descoperit că atât factorul rece cât și cel fierbinte, ambii favorizează avansarea aterosclerozei. Acest rezultat ne spune că acești doi factori ar putea fi considerați ca fiind un factor cauzal în dezvoltarea aterosclerozei. Totuși, mecanismele prin care acești factori contribuie la avansarea aterosclerozei trebuie să fie studiate în continuare.
 
În concluzie, atât factorul rece, cât și factorul fierbinte joacă un rol important în dezvoltarea aterosclerozei la cobaii cu deficiență de apolipoproteină E și această progresie a bolii aterosclerotice a fost semnificativ întârziată de tratamentul cu amigdalină. Funcția inhibitoare a amigdalinei este strâns legată de celulele Treg, fapt care sugerează că administrarea amigdalinei la cobaii cu ateroscleroză poate fi un tratament benefic. Sunt necesare studii ulterioare pentru a determina toxicitatea amigdalinei pe termen lung și pentru a decela alte mecanisme posibile în tratamentul cu amigdalină în cazul aterosclerozei. În orice caz, datele prezentate indică în mod clar faptul că amigdalina ar putea fi un nou medicament în tratamentul aterosclerozei.