pH-ul extracelular acid promoveaza metastazele experimentale ale celulelor de melanom de la om in cazul cobailor fara timus

Einar K. Rofstad, Berit Mathiesen, Kristil Kindem, Kanthi Galappathi

Rezumat

pH-ul extracelular (pH_e) in cazul multor tumori este mai scazut decat pH-ul din tesutul normal corespunzator. Insemnatatea pH_e acid in dezvoltarea metastazelor a fost investigata in studiul de fata. Celule de melanom la om (A-07, D-12 si T-22) au fost cultivate in vitro la pH_e 6,8 sau 7,4 (grupul de control) inainte sa fie inoculate in vena cava a cobailor pentru formarea metastazelor pulmonare experimentale. Invazivitatea celulelor a fost studiata in vitro, folosind camere de invazie Matrigel, ?i angiogeneza a fost studiata in vivo, folosind un test intradermic. Secretia de proteine a fost mpsurata cu teste ELISA si de imunocaptura. Celulele cultivate in mediu cu pH_e acid au prezentat secretii crescute de proteinaze si de factori proangiogenici, potential invaziv si angiogenic crescut si potential crescut pentru a dezvolta metastaze experimentale. Metastazele induse de aciditate au fost inhibate prin tratamentul cu inhibitorul GM6001 al MMP (metaloproteinaze matriceale), inhibitorul E-64 al proteinazei cisteinei, sau cu anticorpul blocant impotriva factorului de crestere vasculara endoteliala A (VEGF-A) sau cu interleukina-8 (IL-8). Studiul de fata arata cu pH_e acid promoveaza metastazele pulmonare experimentale in cazul celulelor de melanom la om A-07, D-12 si T-22, printr-un mecanism ce implica modificarea activitatii enzimelor proteolitice MMP-2, MMP-9 catepsina B si catepsina L  si, de asemenea, modificarea activitatii factorilor proanigiogenici VEGF-A si IL-8 datorita aciditatii tumorale. O consecinta a acestei observatii este ca trebuie evitate strategiile de tratament care implica acidifierea deliberata a tumorii pentru a creste eficienta chimioterapiei, a terapiei fotodinamice si a hipertermiei. In plus, posibilitatea ca pH_e al tumorei primare sa fie un parametru important de prognostic pentru pacientii cu melanom merita sa fie investigata clinic.

Introducere

Tesutul tumoral acumuleaza gradat alterari genomice stabile si instabile in timpul cresterii, rezultand dezvoltarea cu timpul a unui numar crescut de trasaturi fenotipice agresive, proces numit progresia maligna.Concomitent, majoritatea tumorilor dezvolta un mediu local fiziopatologic caracterizat de o presiune scazuta a oxigenului (pO₂), o presiune crescuta a fluidului interstitial, o concentratie scazuta de glucoza, o concentratie crescuta de acid lactic, un pH extracelular (pH_e) scazut si/sau o lipsa de energie. Acest mediu local ostil activeaza mai multi factori de transcriptie, conducand la modificarea expresiei unui numar mare de produsi genetici cunoscuti prin aceea ca promoveaza progresia maligna si raspandirile metastatice.

Investigatiile clinice au aratat ca hipoxia pe termen lung, presiunea crescuta a fluidului interstitial si concentratiile crescute de acid lactic in tumora primara sunt asociate cu incidenta crescuta a metastazelor regionale si distante si, de aici, rate mici de supravietuire in cazul mai multor tipuri histologice de cancer. Totusi, aceste observatii clinice nu afirma in mod necesar ca un mediu local ostil promoveaza metastazele si ratele mici de supravietuire. O interpretare alternativa este ca fenotipurile celulare cele mai agresive si mai metastatice dezvolta cel mai ostil mediu local.

In mai multe laboratoare au fost initiate studii experimentale referitoare la mecanismele din spatele acestor observatii clinice si, astfel, s-a dovedit faptul ca hipoxia (pO₂ < 10 mm Hg) poate promova formarea metastazelor. Astfel, celulele tumorale expuse hipoxiei in vitro au prezentat o invazivitate crescuta in camerele de invazie Matrigel si au crescut potentialul colonizarii plamanilor dupa inocularea intravenoasa la cobai. S-a dovedit ca potentialul metastatic crescut este cauzat de modificarea prin hipoxie a activitatii mai multor produsi genetici care promoveaza metastazele, incluzand aici enzimele proteolitice, factorii proanigiogenici si proteinele antiapoptotice.

Studii experimentale concepute sa investigheze daca pH_e-ul acid (pH_e < 7) poate promova cresterea invaziva si raspandirea metastazelor au dat rezultate contradictorii. Astfel, celulele de melanom la om cultivate in mediu cu pH_e acid in vitro au prezentat invazivitate crescuta in camerle de invazie Matrigel, in timp ce in cazul unor experimente similare cu celule tumorale de la rozatoare nu s-a remarcat aceasta invazivitate crescuta dupa expunerea la un pH_e acid. Celulele tumorale de la rozatoare expuse unui mediu cu pH_e acid in vitro au prezentat un potential crescut de colonizare a plamanilor atunci cand au fost inoculate intravenos in cobaiul gazda singenic, in timp ce acidifierea tumorilor la rozatoare in vivo, obtinuta prin administrarea de meta-iodo-benzilguanidina si/sau glucoza cobailor gazda, nu a condus la o incidenta crescuta a metastazelor pulmonare spontane. In ciuda acestor observatii aparent contradictorii, mai multe studii au indicat ca celulele tumoarle expuse unui mediu cu pH_e acid in vitro pot prezenta o expresie crescuta a mai multor gene cunoscute prin aceea ca promoveaza cresterea invaziva si metastazele. Totusi, nu este clar daca aceasta crestere in expresia genei, indusa prin conditiile acide de mediu, este suficienta pentru a creste potentialul metastatic al celulelor tumorale.

In prezentul studiu este dovedit fara echivoc ca cresterea in vitro in pH_e acid sporeste potentialul celulelor de melanom la om A-07, D-12 si T-22 de a forma metastaze pulmonare experimentale in cazul cobailor fara timus. Deoarece expunerea acuta la pH_e acid s-a dovedit ca provoaca eliberarea factorilor proangiogenici, a factorului de crestere vasculara endoteliala A (VEGF-A) si a interleukinei 8 (IL-8), a metaloproteinazelor matriceale (MMP) MMP-2 (gelatinaza A) si MMP-9 (gelatinaza B) si a proteinazelor cisteinei, catepsina B si catepsina L, am emis ipoteza ca aceste proteine ce promoveaza metastazele au fost implicate in procesul metastatic. Pentru a testa aceasta ipoteza, am masurat secretia acestor proteine in cazul celulelor cultivate in conditii de mediu acide si normale si am investigat daca tratamentul cu inhibitori ai proteinazelor sau cu anticorpi pentru neutralizare poate inhiba invazivitatea indusa de acid, angiogeneza si metastazele experimentale. Experimentele au dat rezultate in concordanta cu ipoteza noastra, aratand clar ca stimularea eliberarii de VEGF-A, IL-8, MMP-2, MMP-9, catepsina B si catepsina L datorita prezentei mediului acid a crescut potentialul metastatic al celulelor A-07, D-12 si T-22, oferind astfel dovezi semnificative asupra faptului ca stimularea eliberarii acestor proteine de catre mediul acid este un posibil mecanism pentru metastazele induse de mediul acid in melanomul malign.

Rezultate

pH_e acid promoveaza metastazele pulmonare experimentale. Efectele pH_e acid asupra viabilitatii celulelor si asupra potentialului metastatic au fost studiate prin cultivarea celulelor A-07, D-12 si T-22 la pH_e 6,8 timp de 0 (control), 24 si 48 de ore. Rezultate similare au fost obtinute pentru cele trei linii de melanom. Eficienta formarii de colonii a scazut in vreme ce potentialul metastatic a crescut cu timpul la pH_e 6,8 (fig. 1A si B). Astfel, numarul metastazelor la plamani a fost mai scazut pentru celulele de control decat in cazul celulelor expuse la pH_e 6,8 timp de 24 de ore (P=0,0053-0,043) si in cazul celulelor expuse la pH_e 6,8 timp de 48 de ore (P=0,0000088-0,00052). Durata cresterii potentialului metastatic indusa de mediul acid a fost studiata prin cultivarea celulelor la pH_e 6,8 timp de 48 de ore, permitand apoi celulelor sa-si revina la pH_e 7,4 timp de 0 (control), 12 si 24 de ore. In aceste experimente , de asemenea, au fost obtinute rezultate similare pentru celulele A-07, D-12 si T-22. Eficienta colonizarii a crescut in vreme ce potentialul metastatic a scazut odata cu cresterea timpului de recuperare la pH_e 7,4 (fig. 1C si D). Astfel, numarul metastazelor la plamani a fost mai mare in cazul celulelor de control decat in cazul celulelor carora li s-a acordat un timp de recuperare de 12 de ore la pH_e 7,4 (P=0,0048-0,031) si in cazul celulelor carora li s-a acordat un timp de recuperare de 24 de ore  la pH_e 7,4 (P=0,000040-0,00027).Potentialul metastatic al celulelor carora li s-a asigurat un timp de recuperare de 24 de ore (fig. 1D) a fost similar cu acela al celulelor de control, netratate (fig. 1B).

 

 

Figura 1.

Eficienta colonizarii celulelor A-07, D-12 si T-22 analizate in vitro (A si C) si potentialul metastatic al celulelor A-07, D-12 si T-22 analizate in vivo (Bsi D). Celulele au fost cultivate in vitro la pH_e 6,8 timp de 0, 24 sau 48 de ore (A si B) sau la pH_e 6,8 timp de 48 de ore si apoi li s-a permis sa se recupereze la pH_e 7,4 timp de 0, 12 sau 24 de ore (C si D) inainte de a fi colonizate in vitro sau inoculate in vena cava a cobailor BALB/c nu/nu pentru formarea metastazelor pulmonare. Numarul de metastaze experimentale dupa inocularea a 2 × 10⁶ celule A-07, 3 × 10⁵ celule D-12 sau 10⁶ celule T-22 a fost folosit ca un parametru pentru potentialul metastatic. Numerele in (B si D) nu au fost corectate pentru diferentele in eficienta colonizarii in (A si C). Coloanele reprezinta media a patru experimente independente care au implicat trei recipiente de cultura fiecare (A si C) si media de 18 pana la 20 cobai (B si D).

pH_e acid creste secretia enzimelor protolitice si a factorilor proangiogenici

Efectele pH_e acid asupra secretiei enzimelor proteolitice si a factorilor proangiogenici au fost studiate prin cultivarea celulelor A-07, D-12 si T-22 intr-un mediu cu pH_e 6,8 si intr-un mediu cu pH_e 7,4 (control) timp de 24 si 48 de ore. Concentratia de proteine din mediul celulelor cultivate la pH_e 6,8, in comparatie cu concentratia de proteine din mediul de control al celulelor cultivate la pH_e 7,4 a fost utilizata ca o masura a cresterii secretiei de proteine, indusa de mediul acid. Rezultatele au fost calitativ similare pentru celulele A-07 (fig. 2A), D-12 (fig. 2B) si T-22 (fig. 2C). Secretia de MMP-2, MMP-9, catepsina B, catepsina L, VEGF-A si IL-8, masurata cu testul ELISA, a fost mai mare la pH_e 6,8 decat la pH_e 7,4, de 1,6 pana la 2,9 ori, in cazul enzimelor proteolitice (P=0,0016-0,039) si de 2,7 pana la 4,7 ori in cazul factorilor proangiogenici (P=0,00035-0,013). Secretia de aMMP-2, pMMP-2, aMMP-9 si pMMP-9, masurata prin utilizarea testelor de activitate enzimatica, a fost mai ridicata la pH_e 6,8  decat la pH_e 7,4 de 1,8 pana la 2,8 ori (P=0,0086-0,022). Cresterea secretiei la pH_e 6,8 a fost similara pentru aMMP-2 si pMMP-2 si, de asemenea, similara pentru aMMP-9 si pMMP-9 in cazul tuturor liniilor de celule [adica raporturile de concentratii intre aMMP-2 si pMMP-2 si intre aMMP-9 si pMMP-9 nu au fost diferite semnificativ la pH_e 6,8 si pH_e 7,4 (P > 0,05 pentru ambele MMP in cazul tuturor liniilor de celule)].

 

Figura 2.

Concentratia de MMP-2, MMP-9, catepsina B, catepsina L, VEGF-A si IL-8 (masurate cu testul ELISA) si concentratia aMMP-2, p-MMP2, aMMP-9 si p-MMP-9 (masurata prin analiza activitatii enzimatice) in mediul celulelor A-07 (A), D-12 (B) si T-22 (C)cultivate la pH_e 6,8 timp de 24 sau 48 de ore, raportata la cea din mediul de celule de control, cultivate la pH_e 7,4 pentru un timp corespunzator. Coloanele reprezinta media a patru experimente implicand fiecare trei mostre.

Invazivitatea celulara este promovata de pH_e acid si este inhibata de inhibitorii proteinazelor si de anticorpi impotriva proteinazelor. Efectele pH_e acid asupra invazivitatii celulelor au fost studiate prin cultivarea celulelor A-07, D-12 si T-22 la pH_e 6,8 sau pH_e 7,4 (control) timp de 48 de ore inainte de a testa invazivitatea celulara la pH_e 7,4 in absenta anticorpilor de neutralizare sau a inhibitorului proteinazei si in prezenta a 5 µg/mL de anticorp anti-MMP-2, 5 µg/mL anticorp anti-MMP-9, 15 µmol/L de GM6001 sau 10 µmol/L de E-64. Numarul celulelor invazive comparativ cu cel al celulelor cultivate in mediu cu pH_e 7,4 si analizate fara anticorpul de neutralizare sau inhibitorul proteinazei a fost utilizat ca un parametru pentru invazivitatea celulelor. Rezultate similare din punct de vedere calitativ au fost obtinutepentru celulele A-07 (fig. 3A), D-12 (fig. 3B) si pentru T-22 (fig. 3C). In absenta anticorpului de neutralizare, invazivitatea celulelor a fost mai mare in cazul celulelor cultivate in mediu cu pH_e 6,8, decat in cazul celulelor cultivate in mediu cu pH_e 7,4, de ~2,8 ori in cazul celulelor A-07 (P=0,00069), de ~2,1 ori in cazul celulelor D-12 (P=0,0015) si de ~2,5 ori in cazul celulelor T-22 (P=0,00095). In prezenta anticorpului anti-MMP-2 sau anti-MMP-9, nu s-au detectat diferente semnificative intre celulele cultivate in mediu cu pH_e 6,8 si celulele cultivate in mediu cu pH_e 7,4. Invazivitatea celulara a fost mai ridicata in absenta, decat in prezenta anticorpului de neutralizare, de 3,5 pana la 7 ori (P=0,000076-0,00080) in cazul celulelor cultivate in mediu cu pH_e 6,8 si de 1,8 pana la 2,8 ori (P=0,0016-0,0098) in cazul celulelor cultivate in mediu cu pH_e 7,4. In absenta inhibitorului proteinazei, invazivitatea celulara a fost mai ridicata in cazul celulelor cultivate in mediu cu pH_e 6,8 decat in cazul celulelor cultivate in mediu cu pH_e 7,4 de ~3,1 ori (A-07; P=0,00051), ~1,9 (D-12; P=0,0018) si ~2,4 ori (T-22; P=0,00071). In prezenta substantelor GM6001 sau E-64, nu s-au detectat diferente semnificative intre celulele cultivate in mediu cu pH_e 6,8 si celulele cultivate in mediu cu pH_e 7,4. Invazivitatea celulara a fost mai ridicata in absenta decat in prezenta substantei GM6001 de 3,3 pana la 7 ori (P=0,00023-0,0011) in cazul celulelor cultivate in mediu cu pH_e 6,8 si de 1,6 pana la 2,6 ori (P=0,0049-0,039) in cazul celulelor cultivate in mediu cu pH_e 7,4. De asemenea, invazivitatea celulara a fost mai ridicata in absenta decat in prezenta substantei E-64 de 3,2 pana la 6,3 ori (P=0,00028-0,0011) in cazul celulelor cultivate in mediu cu pH_e 6,8 si de 1,5 pana la 2,5 ori (P=0,0052-0,048) in cazul celulelor cultivate in mediu cu pH_e7,4.

 

Figura 3.

Invazivitatea celulelor A-07 (A), D-12 (B) si T-22 (C) a fost analizata in vitro folosind camere de invazie Matrigel. Celulele au fost cultivate la pH_e 6,8 sau la pH_e 7,4 timp de 48 de ore inainte de analiza. Invazivitatea celulelor a fost analizata la pH_e 7,4 in absenta anticorpului de neutralizare sau a inhibitorului de proteinaze si in prezenta a 5 µg/mL de anticorp anti-MMP-2, 5 µg/mL de anticorp anti-MMP-9, 15 µmol/L de GM6001 sau 10 µmol/L de E-64. Numarul de celule invazive relativ la acela specific pentru celulele cultivate la pH_e 7,4 si analizat fara anticorpul de neutralizare sau inhibitorul de proteinaze a fost folosit drept parametru pentru invazivitate. Coloanele reprezinta media a patru experimente independente facute de trei ori.

Angiogeneza este promovata de pH_e acid si este inhibata de anticorpii impotriva factorilor proangiogenici. Efectele pH_e acid asupra potentialului angiogenic au fost studiate prin cultivarea celulelor A-07, D-12 si T-22 la pH_e 6,8 sau la pH_e 7,4 (control) timp de 48 de ore inainte de a fi testat potentialul angiogenic in cazul cobailor netratati si al cobailor tratati cu anticorp anti-VEGF-A sau cu anticorp anti-IL-8. Numarul capilarelor de neoformatie cu rol in vascularizatia si in nutritia tumorii raportat la numarul celulelor cultivate la pH_e 7,4 si analizat la cobaii netratati a fost folosit ca parametru pentru potentialul angiogenic. Rezultatele au fost similare din punct de vedere calitativ pentru celulele A-07 (fig. 4A), D-12 (fig. 4B) si T-22 (fig. 4C). In cazul cobailor netratati, potentialul angiogenic a fost mai ridicat pentru celulele cultivate la pH_e 6,8 decat pentru celulele cultivate la pH_e 7,4 de ~1,5 ori (A-07; P=0,0012), ~1,7 ori (D-12; P=0,00028) si de ~1,8 ori (T-22; P=0,00021). In contrast, atunci cand potentialul angiogenic a fost analizat in cazul cobailor tratati cu anticorpi, nu au fost detectate diferente semnificative intre celulele cultivate la pH_e 6,8 si celulele cultivate la pH_e 7,4. Potentialul angiogenic a fost mai ridicat in cazul cobailor netratati decat in cobaii tratati cu anti-VEGF-A de 2,1 pana la 3,8 ori (P=0,0000029-0,00012) pentru celulele cultivate la pH_e 6,8 si de 1,5 pana la 1,7 ori (P=0,00016-0,0069) pentru celulele cultivate la pH_e 7,4; de asemenea, potentialul angiogenic a fost mai ridicat in cazul cobailor netratati decat in cazul cobailor tratati cu anti IL-8 de 2,1 pana la 2,3 ori (P=0,00024-0,0020) pentru celulele cultivate la pH_e 6,8. In cazul celulelor cultivate la pH_e 7,4, potentialul angiogenic a fost mai ridicat in cazul cobailor netratati decat in cazul cobailor tratati cu anti-IL-8 pentru celulele A-07 (P=0,034) si D-12 (P=0,0025), dar nu si pentru celulele T-22 (P > 0,05).

 

Figura 4.

Potentialul angiogenic al celulelor A-07 (A), D-12 (B) si T-22 (C) a fost testat in vivo folosind un test intradermic de angiogeneza. Celulele au fost cultivate in vitro la pH_e 6,8 sau la pH_e 7,4 timp de 48 de ore inainte de a fi inoculate la nivelul dermei cobailor BALB/c nu/nu pentru initierea angiogenezei si formarea tumorei. Potentialul angiogenic a fost analizat in cazul cobailor netratati si in cazul cobailor tratati cu anticorp anti-VEGF-A sau anticorp anti-IL-8 prin numararea capilarelor de la nivelul dermei orientate catre tumorile care s-au dezvoltat in locurile de inoculare. Numarul capilarelor orientate catre tumori la 7 zile dupa inocularea a 10⁶ celule relativ la acela specific pentru celulele cultivate la pH_e 7,4 si analizat la cobaii netratati a fost folosit ca un parametru pentru potentialul angiogenic. Coloanele reprezinta media de 16 pana la 20 de inoculari cu celule tumorale.

Metastazele induse de aciditate sunt inhibate de inhibitorii proteinazei si de anticorpii impotriva factorilor proangiogenici. Efectele tratamentului metastazelor pulmonare experimentale induse de aciditate cu inhibitorii proteinazei si cu anticorpi impotriva factorilor proangiogenici au fost studiate prin cultivarea celulelor A-07, D-12 si T-22 la pH_e 6,8 sau la pH_e 7,4 (control) timp de 48 de ore inainte de analizarea potentialului metastatic la cobaii netratati si la cei tratati cu GM6001, E-64 sau cu anticorpi impotriva VEGF-A sau IL-8. Rezultate similare din punct de vedere calitativ au fost obtinute pentru celulele A-07, D-12 si T-22, in cazul in care cobaii gazda au fost tratati cu inhibitori ai proteinazelor (fig. 5) sau cu anticorpi impotriva factorilor proangiogenici (fig. 6). In cazul cobailor netratati, numarul metastazelor a fost mai mare pentru celulele cultivate la pH_e 6,8 decat pentru celulele cultivate la pH_e 7,4 de 1,9 pana la 2 ori (A-07; P=0,000011-0,000071; fig. 5A si 6A), de 1,5 pana la 1,6 ori (D-12; P=0,00029-0,0071; fig. 5B si 6B) si de 2,3 pana la 2,7 orin (T-22; P=0,0000016-0,000010; fig. 5C si 6C). In cazul cobailor tratati, nu s-au detectat diferente semnificative intre celulele cultivate la pH_e 6,8 si celulele cultivate la pH_e 7,4, desi numarul metastazelor a avut tendinta sa fie mai ridicat pentru celulele cultivate la pH_e 6,8 decat pentru pentru celulele cultivate la pH_e 7,4 in cazul tuturor tratamentelor. Numarul metastazelor a fost mai ridicat in cazul cobailor netratati decat in cazul cobailor tratati cu inhibitorii proteinazelor de 1,7 pana la 3,5 ori (P=0,00000064-0,00012) pentru celulele cultivate la pH_e 6,8 si de 1,4 pana la 1,8 ori (P=0,0017-0,047) pentru celulele cultivate la pH_e 7,4 (fig. 5A-C); de asemenea, numarul metastazelor a fost mai ridicat in cazul cobailor netratati decat in cazul cobailor tratati cu anticorpi impotriva factorilor proangiogenici de 2 pana la 3,7 ori (P=0,00000010-0,000032) pentru celulele cultivate la pH_e 6,8 si de 1,5 pana la 2,4 ori (P=0,0013-0,044) pentru celulele cultivate la pH_e 7,4 (fig. 6A-C).

 

Figura 5.

Potentialul metastatic al celulelor A-07 (A), D-12 (B) si T-22 (C) a fost analizat in cazul cobailor BALB/c nu/nu. Celulele au fost cultivate in vitro la pH_e 6,8 sau pH_e 7,4 timp de 48 de ore inainte de a fi inoculate in vena cava pentru formarea metastazelor pulmonare. Potentialul metastatic a fost analizat in absenta inhibitorului proteinazei si in prezenta GM6001 sau E-64. Numarul metastazelor experimentale dupa inocularea a 2 × 10⁶ celule A-07, 3 × 10⁵ celule D-12 sau 10⁶ celule T-22 a fost folosit ca un parametru pentru potentialul metastatic. Coloanele reprezinta media de 18 pana la 20 cobai.

 

Figura 6.

Potentialul metastatic al celulelor A-07 (A), D-12 (B) si T-22 (C) a fost analizat in cazul cobailor BALB/c nu/nu. Celulele au fost cultivate in vitro la pH_e 6,8 sau pH_e 7,4 timp de 48 de ore inainte de a fi inoculate in vena cava pentru formarea de metastaze pulmonare. Potentialul metastatic a fost analizat in cazul cobailor netratati si in cazul cobailor tratati cu anticorp anti-VEGF-A sau anticorp anti-IL-8. Numarul metastazelor experimentale dupa inocularea a 2 × 10⁶ celule A-07, 3 × 10⁵ celule D-12 sau 10⁶ celule T-22 a fost folosit ca un parametru pentru potentialul metastatic. Coloanele reprezinta media de 18 pana la 20 cobai.

Discutie

Raspandirea metastatica a celulelor maligne de la tumora primara la organele indepartate este cauza majora a mortii pacientilor bolnavi de cancer. Astfel, pacientii cu melanom avansat pot devolta metastaze la nivelul mai multor organe indepartate, incluzand plamanii. pH_e al melanomului la om, masurat cu ajutorul electrozilor, este in domeniul 6,4 – 7,3 sau 6,6 – 7. Aceste valori sunt substantial mai scazute decat acelea de 7,3 – 7,6 masurate pentru pielea omului. Studiul de fata arata ca pH_e acid promoveaza metastazele pulmonare experimentale ale celulelor de melanom la om A-07, D-12 si T-22 in cazul cobailor BALB/c nu/nu. Astfel, este de conceput ca pH_e acid din cazul tumorei primare poate promova metastazele melanomului la oameni si, asadar, pH_e se pare ca este un parametru important de prognostic pentru pacientii cu melanom.

Aceasta opinie este bazata pe asumptia ca liniile de melanom folosite in studiul nostru preclinic sunt modele adecvate pentru melanomul la om. Aceasta asumptie este probabil valida pentru ca melanoamele A-07, D-12 si T-22 se pare ca au retinut mai multe trasaturi biologice importante ale tumorilor prezente la pacientii donori dupa transplantarea la cobaii BALB/c nu/nu, incluzand mai multi parametri fiziopatologici, sensibilitatea la tratament, potentialul angioogenic si abilitatea de a forma metastaze la plamani. Totusi, in studiul de fata, celulele de melanom au fost inoculate direct in circulatia sanguina a cobailor dupa ce au fost expuse la pH_e acid sau normal in vitro. Astfel, experimentele noastre iau in considerare doar ultima parte a procesului metastatic (adica oprirea si cresterea celulelor de melanom in locurile secundare). Asadar, sunt justificate din plin studii ale relatiilor posibile intre pH_e al tumorei primare si dezvoltarea metastazelor spontane in xenogrfturile melanomului de la om.

Studiul de fata este primul studiu care arata fara echivoc faptul ca celulele tumorale de la om expuse unui pH_e acid in vitro pot dobandi un poten?ial crescut pentru a dezvolta metastaze experimentale in vivo. Totusi, s-a aratat anterior ca expunerea la pH_e acid in vitro poate favoriza potentialul de colonizare a plamanilor de catre celulele tumorale ale rozatoarelor. In aceste experimente, celulele KHT si B16 au fost expuse la pH_e 6,5 timp de 48 de ore si apoi li s-a permis sa se recupereze la pH_e 7,4 timp de o, 24 si 48 de ore inainte de a fi inoculate intravenos in cobai singeneici. Potentialul celulelor de colonizare a plamanilor nu a crscut imediat dupa expunerea la pH_e acid, ci a crescut semnificativ odata cu creseterea timpului de recuperare la pH_e normal. Pe de alta parte, celulele de melanom folosite de noi au prezentat un potential metastatic semnificativ crescut imediat dupa ce au fost expuse la pH_e 6,8 timp de 48 de ore si apoi potentialul metastatic a scazut odata cu cresterea timpului de recuperare la pH_e 7,4. Astfel, kinetica creseterii potentialului metastatic indusa de mediul acid a fost complet diferita pentru celulele de melanom de la om si pentru celulele tumorale de la rozatoare, sugerand prin aceasta ca au fost implicate mecanisme fundamental diferite.

Dezvoltarea metastazelor experimentale este un proces complex compus dintr-o cascada de pasi legati, secventiali si foarte selectivi, incluzand supravietuirea celulelor tumorale in circulatia sanguina, oprirea lor in patul capilar al organelor secundare, invazia in interstitiile si parenchimul organelor secundare, proliferarea si inductia angiogenezei. Metastazele induse de aciditate in cazul celulelor de melanom folosite in studiul de fata au fost cel mai probabil o consecinta a invaziei sporite, precum si a angiogenezei sporite la nivelul plamanilor, deoarece celulele crescute in pH_e acid s-au dovedit ca prezinta invazivitate crescuta in camerele de invazie Matrigel si, de asemenea, angiogeneza sporita la nivelul dermei cobailor BALB/c nu/nu.

pH_e acid a indus eliberarea crescuta de aMMP-2, pMMP-2, aMMP-9, pMMP-9, catepsina B si catepsina L in cazul tuturor liniilor de melanom. Tratamentul cu anticorp de blocare impotriva MMP-2 sau MMP-9 a inhibat invazia celulara in vitro si invazia celulara, precum si metastazele experimentale in vivo au fost inhibate de tratamentul cu inhibitorul general pentru MMP, GM6001 sau cu inhibitorul E-64. In plus, celulele cultivate la pH_e 6,8 si celulele cultivate la pH_e 7,4 nu au diferit semnificativ in invazivitate si in potential metastatic atunci cand au fost testate in prezenta GM6001 sau E-64. Prin urmare, metastazele induse de mediul acid in cazul celulelor de melanom din studiul de fata au fost cel mai probabil, in parte, rezultatul invaziei crescute cauzata de eliberarea sporita, indusa de mediul acid, a MMP-2, MMP-9, catepsina B si catepsina L. Aceasta concluzie este in acord cu un numar mare de studii experimentale si clinice care sugereaza ca aceste enzime proteolitice este foarte posibil sa joace roluri importante in procesul metastatic intr- mare varietate de tipuri de tumori.

Factorii proangiogenici VEGF-A si IL-8 au fost, de asemenea, eliberati in cantitati crescute in mediul cu pH_e acid si potentialul angiogenic, precum si cel metastatic al tuturor liniilor de melanom a fost redus atunci cand a a fost analizat la cobaii tratati cu anticorpi de blocare impotriva VEGF-A sau IL-8, urmarea fiind ca nu au existat diferente semnificative intre celulele cultivate la pH_e 6,8 si celulele cultivate la pH_e 7,4. Prin urmare, eliberarea sporita de VEGF-A si IL-8, indusa de mediul acid, este foarte posibil sa fi contribuit la formarea metastazelor induse de mediul acid, prin promovarea angiogenezei. Aceasta concluzie este in acord cu datele experimentale si clinice care arata corelatii pozitive intre metastaze, angiogeneza si expresia VEGF-A sau IL-8 in mai multe tipuri histologice de cancer, incluzand melanomul malign.

Eliberarea crescuta de VEGF-A si IL-8, provocata de mediul acid, este posibil sa fi promovat formarea metastazelor nu numai prin promovarea angiogenezei, ci si prin promovarea extravazarii si invaziei la nivelul plamanilor. Astfel, s-a aratat ca expresia crescuta a IL-8 poate conduce la cresterea semnificativa a MMP-2 in cazul melanomului la om si ca cresetera VEGF-A poate conduce la expresia crescuta a proteinazelor celulelor endoteliale si, de aici, degradarea sporita a membranei bazale. In plus, VEGF-A, cunoscut de asemenea ca un factor de permeabilitate vasculara, are abilitatea de a induce scurgerea vasculara in cazul mai multor organe, prin inducerea formarii spatiilor interendoteliale si a ferestrelor endoteliale.

Metastazele induse de aciditate observate in studiul de fata au fost un fenomen trecator. Atunci cand celulelor de melanom li s-a permis sa se recupereze la pH_e 7,4 dupa ce au fost expuse la pH_e 6,8 timp de 48 de ore, potentialul metastatic a revenit in 24 de ore la potentialul metastatic al celulelor de control, netratate, rezultand ca numarul metastzelor numarate la 5-7 saptamani dupa inocularea cu celule tumorale a fost determinat de starea celulelor in cobai in timpul primelor 24 de ore. Asadar, a fost necesar sa inoculam celulele direct in circulatia sanguina pentru formarea metastazelor experimentale, pentru a fi in stare sa detectam cresterea potentialului metastatic indusa de mediul acid. Probabil ca potentialul metastatic crescut n-ar fi fost cu putinta sa fie detectat in cazul inocularii celulelor intradermic pentru dezvoltarea tumorilor primare si a metastazelor spontane, datorita duratei scurte a acestui fenomen.

Expunerea acuta a celulelor tumorale la pH_e acid s-a aratat ca provoaca eliberarea tranzitorie a unui numar mare de gene, aspect aflat in acord cu natura trecatoare a cresterii potentialului metastatic indusa de mediul acid in cazul celulelor de melanom din studiul de fata. Metastazele induse de mediul acid observate in acest studiu sunt foarte probabil rezultatul efectelor induse de enzimele proteolitice si de factorii proangiogenici in primele 24 de ore dupa inocularea celulelor tumorale. Efectul permeabilizarii vasculare dat de VEGF-A devine evident in cateva minute dupa ce microvasele sunt expuse la VEGF-A si conduce la formarea unui gel extravascular de fibrina crae serveste ca substrat pentru cresterea endoteliala si a celulelor tumorale. Acest efect al VEGF-A este posibil sa fi contribuit la metastazele induse de mediul acid, nu numai prin facilitarea extravazarii celulelor de melanom, dar si prin stimularea proliferarii celulelor de melanom si prin promovarea angiogenezei. In plus, studiile de microscopie intravitala au aratat ca celulele tumorale metastatice singulare si celulele endoteliale se pot atrage unele pe altele, probabil prin secretarea unor molecule chimice de semnalizare ce implica factorii proangiogenici si enzimele proteolitice, si sunt dovezi semnificative asupra faptului ca prin inhibarea acestei comunicari intr-un stadiu timpuriu (adica inainte de declansarea angiogenezei vizibile) poate conduce la distrugerea masiva a celulelor tumorale. Astfel, este posibil ca eliberarea crescuta de factori proangiogenici si de enzime proteolitice, indusa de mediul acid, sa fi contribuit in studiul de fata la formarea metastazelor induse de mediul acid, prin facilitarea comunicarii dintre celulele melanomului si celulele endoteliale.

Cresterea in pH_e acid a indus schimbari similare in cazul celulelor A-07, D-12 si T-22, in ceea ce priveste secretia de proteinaze si de factori proangiogenici, invazivitatea celulara in vitro, poten?ialul angiogenic in vivo ?i poten?ialul de a dezvolta metastaze experimentale. Aceasta observa?ie sugereaza ca metastazele pulmonare in cazul melanomului la om pot fi promovate de pH_e acid printr-un mecanism comun ce implica eliberarea crescuta de enzime proteolitice MMP-2, MMP-9, catepsina B si catepsina L si a factorilor proangiogenici VEGF-A si IL-8. Este rezonabil sa presupunem ca si alte enzime proteolitice si alti factori proangiogenici decat aceia analizati in studiul de fata este posibil sa fi fost eliberati in cantitati crescute in mediul cu pH_e acid si, deci, este posibil sa fi contribuit la cresterea potentialului metastatic al celulelor de melanom in conditii de mediu acide. In plus, studiul de fata nu exclude posibilitatea ca sa fie implicate si alte mecanisme fundamental diferite.

Studiile experimentale au aratat ca pH_e acid poate spori efectele terapeutice in cazul anumitor tratamente impotriva cancerului, incluzand hipertermia, anumite forme de chimioterapie si anumite forme de terapie fotodinamica. Mai multe strategii pentru reducerea pH_e al tumorilor sunt in prezent evaluate in vederea cresterii eficientei acestor tratamente si s-a aratat faptul ca acidifierea tumorii cu ajutorul glucozei si/sau cu inhibitori mitocondriali poate spori efectele antitumorase ale caldurii, ale agentilor chimioterapeutici slab acizi si ale terapiei fotodinamice mediata de acidul aminolevulinic. Studiul de fata sugereaza ca strategiile de tratament care implica acidifierea deliberata a tumorii trebuie sa fie evitate deoarece pH_e acid poate creste potentialul metastatic al celulelor tumorale.

Studiile celulelor in cultura si la nivelul tumorilor experimentale au aratat ca inhibitorii specifici ai proteinelor de transport Na⁺/H⁺ si ai altor pompe de protoni de la nivelul membranei pot creste efectele antitumorale ale unui numar crescut de agenti chimioterapeutici, fie prin sporirea efectelor lor citotoxice sau de inducere a apoptozei, fie prin inhibarea proceselor care provoaca rezistenta la medicamente. In lumina studiului de fata, este posibil ca inhibitorii pompelor de protoni sa inhibe, de asemenea, si metastazele prin cresterea pH_e al tumorilor. In aceasta directie, este necesar sa fie efectuate studii experimentale care sa investigheze aceasta posibilitate.

In concluzie, studiul de fata arata faptul ca pH_e acid promoveaza metastazele pulmonare experimentale ale celulelor de melanom de la om A-07, D-12 si T-22 in cazul cobailor fara timus, prin cresterea expresiei enzimelor proteolitice MMP-2, MMP-9, catepsina B si catepsina L si a factorilor proangiogenici VEGF-A si IL-8. Un aspect important ce rezulta dintru aceasta observatie este ca strategiile de tratament care implica acidifierea deliberata a tumorii pot genera efecte secundare nedorite, de promovare a metastazelor si, astfel, aceste strategii de tratament trebuie evitate. Mai mult, sunt din plin justificate studiile clinice care sa investigheze posibilitatea ca pH_e al tumorii primare sa fie un parametru important de prognostic pentru pacientii cu melanom.